甘蓝型油菜抗草甘膦基因的染色体定位及连锁标记开发
这是一篇关于甘蓝型油菜,抗草甘膦性状,MutMap+定位,SSR,InDel的论文, 主要内容为甘蓝型油菜具有丰富的食用、油用、饲用、旅游观光等价值。在甘蓝型油菜的生产中,田间杂草危害植株的问题一直存在。杂草的生长导致甘蓝型油菜的养分被争夺,从而生产效率低下。使用选择性除草剂则除草不彻底,而如草甘膦、草丁膦这类除草效果好的除草剂由于没有选择性,也无法在油菜上使用。因此,如果能获得稳定、高产、优质、抗草甘膦的基因工程油菜品系,就能较好地解决我国油菜生产的草害问题。田间种植中,对转入了抗草甘膦CP4-EPSPS基因的甘蓝型油菜其后代的草甘膦抗性进行鉴定。抗草甘膦株系喷施草甘膦除草剂之后,植株并不会枯萎,但是其花器官受到药害非常严重,导致抗草甘膦材料难以和其它材料杂交转育。针对上述甘蓝型油菜抗草甘膦性状转育问题,本研究利用抗草甘膦的转CP4-EPSPS基因油菜SWUWY-35与感草甘膦纯系甘蓝型黄籽油菜L804杂交获得F1代,以F1代自交获得F2代1:1抗草甘膦、感草甘膦分离群体,研究抗草甘膦CP4-EPSPS基因遗传规律。基于BSA分析法,构建抗草甘膦、感草甘膦子代池,进行全基因组重测序,再利用Mut Map+方法定位CP4-EPSPS基因在染色体上的候选区间。在候选区间内利用MISA及IGV软件开发与CP4-EPSPS基因紧密连锁的SSR分子标记及In Del分子标记。为甘蓝型油菜抗草甘膦植株的选育提供方法学基础。主要研究结果如下:1.草甘膦抗性性状遗传规律观察。田间种植转CP4-EPSPS基因抗草甘膦植株SWUWY-35,感草甘膦植株西南大学纯系黄籽油菜植株L804,将它们杂交产生F1代群体,F1代自交获得F2代性状分离群体共86株,在苗期取材后喷施草甘膦除草剂并观察记录分离群体表现的草甘膦抗性性状,其中抗草甘膦单株37株,感草甘膦单株49株,卡方检测草甘膦抗性分离比符合期望理论值1:1(χ2<χ20.05),且不受环境影响。初步分析确认草甘膦抗性性状符合单基因控制的遗传模式,属于质量性状。2.草甘膦抗性基因候选区间的染色体定位。基于BSA分析法理论,使用抗草甘膦亲本与感草甘膦亲本构建的F2代分离群体,对F2代分离群体提取叶片DNA构建抗草甘膦子代池及感草甘膦子代池,进行深度30×重测序,以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh为参考基因组,对抗草甘膦亲本SWUWY-35、感草甘膦亲本L804和抗草甘膦、感草甘膦子代池重测序及进行数据预处理,用组学分析流程Mut Map+,将抗草甘膦基因候选区间锁定在甘蓝型油菜A01染色体19.5～20.5Mb区间内。3.SSR分子标记开发及验证。在A01染色体的19.5～20.5Mb候选区间附近使用MISA软件识别微卫星和复合微卫星序列,结合命令行引物设计软件Primer3,快速高效批量设计候选区间附近SSR引物,共设计了50对SSR标记。对标记分别对草甘膦抗性及感性植株DNA进行PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染显影后,获得5个SSR标记与草甘膦抗性性状紧密连锁。4.In Del分子标记开发及验证。通过IGV软件可视化亲本和抗、感子代池在候选区间内的In Del变异,找到大于5个碱基的插入和缺失位点,使用IGV软件锁定此区间内In Del的起始和终止位置并设计In Del引物,共设计了38对In Del标记。38对标记分别对草甘膦抗性及感性植株DNA进行PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染显影后,获得4个In Del标记与草甘膦抗性性状紧密连锁。
甘蓝型油菜耐盐种质筛选与耐盐相关基因克隆
这是一篇关于甘蓝型油菜,耐盐,种质筛选,分子标记,基因克隆及表达的论文, 主要内容为油菜作为我国主要的油料作物之一,对保障我国油料安全至关重要。近年来,我国油菜主产区的油菜播种面积呈现下降的趋势,严重影响了我国食用油的安全,因此急需增加新的油菜播种面积。然而,目前土壤盐碱化问题限制了我国油菜产业的发展。研究油菜的耐盐性既有助于盐碱地有效开发利用,又可以保障我国油料供应。本研究对甘蓝型油菜芽期和苗期耐盐性进行鉴定,筛选耐盐油菜种质;利用课题组前人对耐盐相关性状全基因组关联分析获得的主效位点开发耐盐分子标记,在上述鉴定材料中进行验证;并对耐盐基因进行了克隆和分析。取得了以下研究结果:1.甘蓝型油菜耐盐种质的筛选(1)200 mmol/L和230 mmol/L的Na Cl模拟盐胁迫对123份甘蓝型油菜品系进行芽期耐盐性鉴定,测定发芽率、芽长、根长等指标,结合主成分分析、隶属函数及聚类分析,筛选获得了35份耐盐油菜种质,其中高度耐盐种质3份,为P4、P64、P79;中度耐盐种质4份,包括P7、P9、P15、P92;一般耐盐种质7份,包括P2、P10、P11等;低耐盐种质21份。(2)为筛选能在芽期与苗期均耐盐的甘蓝型油菜种质,对芽期筛选到的10份耐盐材料和10份敏盐材料进行苗期耐盐性鉴定。采用梯度盐浓度处理的方法,测定分析相关指标,发现240 mmol/L Na Cl是鉴定供试材料苗期耐盐性较为合适的浓度。采用相对完全展开绿叶数、盐害指数、耐盐性综合评价值D值等三种评价指标进行苗期耐盐性评价。综合不同评价方式分级和得分情况,筛选获得了5份在苗期耐盐的甘蓝型油菜种质P71、P9、P15、P18与P24。(3)利用75 mmol/L的Na HCO3溶液对上述20份材料进行芽期碱性盐胁迫,采用隶属函数和聚类分析的方法,筛选获得了P4、P7、P9等10份芽期耐碱性盐材料。其中,P9、P15在中性盐处理下的芽期、苗期及碱性盐处理下的芽期均表现出了较强的耐盐性。2.芽期耐盐分子标记的开发利用前人对146份甘蓝型油菜种质盐胁迫下发芽势、发芽率、相对盐害指数进行全基因组关联分析获得的主效SNP位点,设计了78对引物用于油菜芽期耐盐分子标记开发。7对引物在本研究鉴定的极耐盐和极敏盐骨干材料中表现出多态性,其中S2＿3＿879标记能够区分极耐盐与极敏盐材料。3.耐盐相关基因的克隆和表达分析从耐盐品系P2和敏盐品系P76中分别克隆耐盐相关基因Bna A02g05440D和Bna A03g50460D,对其进行生物信息学分析及表达量分析。在两份材料中克隆得到基因的核苷酸序列存在位于内含子、外显子上的差异,但氨基酸序列一致。基因Bna A02g05440D编码246个氨基酸,属于J结构域蛋白。基因Bna A03g50460D编码75个氨基酸属于UPF0057家族。荧光定量结果表明,随着盐胁迫处理时间延长,Bna A02g05440D基因的表达量在两材料中均发生显著下调,在耐盐材料中下调幅度高于敏盐材料。Bna A03g50460D基因的表达量在两材料中呈现波动变化,为先下降后上升再下降的趋势。本研究通过筛选甘蓝型油菜耐盐种质、开发耐盐分子标记以及克隆耐盐相关基因,为甘蓝型油菜耐盐分子育种提供了材料基础。
甘蓝型油菜花叶基因染色体定位及候选基因分析
这是一篇关于甘蓝型油菜,重测序,花叶基因,基因定位,克隆的论文, 主要内容为油菜是十字花科(Cruciferace)芸薹属(Brassica)作物,一年或越年生草本植物。其籽可以用于榨油,是我国主要的油料作物之一。油菜具有极高的经济价值,除了作为重要的油料作物外,其还可以作为蔬菜食用,拥有降低血脂等功效,同时油菜还具有肥用,蜜用等优点。随着对油菜研究的深入,油菜叶型的研究逐渐受到重视。油菜花叶是重要的形态标记性状,可用于杂种鉴别,纯种鉴定以及品种资源保护等方面。通过对花叶基因染色体物理区间鉴定以及候选基因的克隆分析,可以丰富甘蓝型油菜主效基因正向遗传学内容。本研究以甘蓝型油菜花叶R01、圆叶R02为亲本材料,杂交获得F1群体,F1群体再自交得到F2分离群体。利用F2代群体构建DNA子代池,对花叶和圆叶亲本及其DNA子代池进行30×重测序,利用QTL-seq以及QTL＿seq R包流程定位甘蓝型油菜花叶基因候选区间,并在候选区间内开发与花叶基因紧密连锁的In Del和SSR标记,之后根据GO富集以及KEGG富集分析,同时与拟南芥同源基因比对分析及功能注释,再进过q RT-PCR验证,筛选出与花叶有关的候选基因,并对候选基因克隆以及一系列生物信息学的分析。1、花叶遗传规律分析以甘蓝型油菜花叶R01和圆叶R02为亲本,杂交得到3份F1代材料,分别命名为20W1、W398、W400,各自自交得到F2代群体,对F2代群体进行表型观察:20W1材料中328株单株有247株圆叶,81株花叶,W398材料中53株中有43株圆叶,10株花叶,W400材料中46株中有35株圆叶,11株花叶。通过卡方测验,结果显示圆叶和花叶的分离比为3:1(χc2<χ0.052),推测花叶基因受一对隐性主效基因控制。2、花叶基因定位以F2代分离群体中花叶和圆叶的单株叶片为材料。运用混合分组分析法(BSA)构建子代DNA子代池,对亲本花叶和圆叶及其子代池进行30×全基因组重测序分析,根据法国甘蓝型油菜参考基因组,利用QTL-seq和QTL＿seq R包流程对花叶和圆叶DNA子代池进行分析,将花叶候选基因定位在甘蓝型油菜A10染色体16.35-17.35Mb之间。3、In Del和SSR标记开发利用碱基可视化软件(IGV),在前期定位区间内通过查找对花叶、圆叶亲本及其子代池之间的插入或者缺失碱基5个以上的In Del变异位点。设计In Del引物,共设计了39对引物,之后以亲本和F2代花叶、圆叶DNA为模板,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对这些引物进行多态性筛选,共筛选出2对与花叶性状紧密连锁的的In Del标记。利用MISA软件在花叶基因候选区间内通过识别微卫星以及复合微卫星序列,运用引物设计软件Primer3可以在花叶基因候选区间内快速的批量设计SSR引物,共设计了42对SSR引物,之后以亲本和F2代花叶和圆叶为模板,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的SSR标记,共筛选出2对与花叶性状紧密连锁的SSR标记。4、候选基因分析本研究将花叶基因定位在A10染色体16.35-17.35Mb之间,该区间内共有223个基因。通过GO富集和KEGG富集分析,共有两个基因被富集到与叶片形成有关的通路,分别是基因Bna A10g26320D和基因Bna A10g27130D。对这两个基因与拟南芥上的同源基因比对以及功能注释,基因Bna A10g26320D的同源基因为AT5G03790,该基因与LYF相互作用激活CAL表达,同时参与叶片形态发生。基因Bna A10g27130D的同源基因为AT5G02410,该基因参与编码一种α1,2-葡萄糖基转移酶(ALG10),该酶是脂质连接寡糖生物合成以及叶片发育所必须的。因此推测基因Bna A10g26320D可能为控制花叶性状的候选基因。之后对基因Bna A10g26320D进行q RT-PCR分析,结果表明基因Bna A10g26320D在花叶叶片中的表达量显著高于圆叶叶片中,进一步提高了推测基因Bna A10g26320D为花叶候选基因的准确性。5、候选基因克隆及生物信息学分析以F2代花叶和圆叶叶片为材料,对基因Bna A10g26320D进行克隆,比对两条序列发现有17个碱基差异,翻译成氨基酸有9个氨基酸差异。对基因Bna A10g26320D编码蛋白质进行生物信息学分析:基因Bna A10g26320D在花叶和圆叶材料中编码蛋白质均为亲水蛋白;两种蛋白均不是膜蛋白或分泌蛋白;该基因在花叶中编码的蛋白质磷酸化位点有25个,在圆叶中编码的蛋白质磷酸化位点有23个;该基因在花叶中编码的蛋白质的二级结构包括50.92%的α螺旋结构;10.09%的扩展链结构;38.99%的无规则卷曲结构,在圆叶中编码的蛋白质的二级结构包括52.05%的α螺旋结构;10.05%的扩展链;37.90%的无规则卷曲结构。基因Bna A10g26320D在两种材料中编码蛋白质的三级结构基本相同。
甘蓝型油菜耐盐种质筛选与耐盐相关基因克隆
这是一篇关于甘蓝型油菜,耐盐,种质筛选,分子标记,基因克隆及表达的论文, 主要内容为油菜作为我国主要的油料作物之一,对保障我国油料安全至关重要。近年来,我国油菜主产区的油菜播种面积呈现下降的趋势,严重影响了我国食用油的安全,因此急需增加新的油菜播种面积。然而,目前土壤盐碱化问题限制了我国油菜产业的发展。研究油菜的耐盐性既有助于盐碱地有效开发利用,又可以保障我国油料供应。本研究对甘蓝型油菜芽期和苗期耐盐性进行鉴定,筛选耐盐油菜种质;利用课题组前人对耐盐相关性状全基因组关联分析获得的主效位点开发耐盐分子标记,在上述鉴定材料中进行验证;并对耐盐基因进行了克隆和分析。取得了以下研究结果:1.甘蓝型油菜耐盐种质的筛选(1)200 mmol/L和230 mmol/L的Na Cl模拟盐胁迫对123份甘蓝型油菜品系进行芽期耐盐性鉴定,测定发芽率、芽长、根长等指标,结合主成分分析、隶属函数及聚类分析,筛选获得了35份耐盐油菜种质,其中高度耐盐种质3份,为P4、P64、P79;中度耐盐种质4份,包括P7、P9、P15、P92;一般耐盐种质7份,包括P2、P10、P11等;低耐盐种质21份。(2)为筛选能在芽期与苗期均耐盐的甘蓝型油菜种质,对芽期筛选到的10份耐盐材料和10份敏盐材料进行苗期耐盐性鉴定。采用梯度盐浓度处理的方法,测定分析相关指标,发现240 mmol/L Na Cl是鉴定供试材料苗期耐盐性较为合适的浓度。采用相对完全展开绿叶数、盐害指数、耐盐性综合评价值D值等三种评价指标进行苗期耐盐性评价。综合不同评价方式分级和得分情况,筛选获得了5份在苗期耐盐的甘蓝型油菜种质P71、P9、P15、P18与P24。(3)利用75 mmol/L的Na HCO3溶液对上述20份材料进行芽期碱性盐胁迫,采用隶属函数和聚类分析的方法,筛选获得了P4、P7、P9等10份芽期耐碱性盐材料。其中,P9、P15在中性盐处理下的芽期、苗期及碱性盐处理下的芽期均表现出了较强的耐盐性。2.芽期耐盐分子标记的开发利用前人对146份甘蓝型油菜种质盐胁迫下发芽势、发芽率、相对盐害指数进行全基因组关联分析获得的主效SNP位点,设计了78对引物用于油菜芽期耐盐分子标记开发。7对引物在本研究鉴定的极耐盐和极敏盐骨干材料中表现出多态性,其中S2＿3＿879标记能够区分极耐盐与极敏盐材料。3.耐盐相关基因的克隆和表达分析从耐盐品系P2和敏盐品系P76中分别克隆耐盐相关基因Bna A02g05440D和Bna A03g50460D,对其进行生物信息学分析及表达量分析。在两份材料中克隆得到基因的核苷酸序列存在位于内含子、外显子上的差异,但氨基酸序列一致。基因Bna A02g05440D编码246个氨基酸,属于J结构域蛋白。基因Bna A03g50460D编码75个氨基酸属于UPF0057家族。荧光定量结果表明,随着盐胁迫处理时间延长,Bna A02g05440D基因的表达量在两材料中均发生显著下调,在耐盐材料中下调幅度高于敏盐材料。Bna A03g50460D基因的表达量在两材料中呈现波动变化,为先下降后上升再下降的趋势。本研究通过筛选甘蓝型油菜耐盐种质、开发耐盐分子标记以及克隆耐盐相关基因,为甘蓝型油菜耐盐分子育种提供了材料基础。
甘蓝型油菜隐性纯合两型系不育基因的染色体定位及候选基因初步筛选
这是一篇关于甘蓝型油菜,重测序,基因定位,转录组测序,基因克隆的论文, 主要内容为杂种优势是提高作物产量,改善作物品质的重要手段,杂种优势是否得到充分利用的关键在于是否有良好的授粉控制系统及优秀的亲本材料,甘蓝型油菜隐性核不育系品种9012A是由安徽农科院所选育,其授粉系统在国内处于领先地位,该系统通过引进临保系来实现三系制种,它在生产中避免了需要拔出50%可育株的问题。纯合两型系的遗传背景是否一致以及是否选育出合格的临保系是实现三系制种的关键,因此定位纯合两型系不育基因并开发与育性基因连锁的分子标记对生产有着指导意义。本研究以甘蓝型油菜隐性纯合两型系WSLA和WSLB为材料,兄妹交获得子代群体,子代群体构建不育、可育DNA子代池,分别采用Mutmap+以及QTL＿seq R两种不同的流程来分析定位不育基因的候选区间,在候选区间内分别利用MISA软件和IGV软件开发有稳定多态性的SSR及InDel分子标记。参考法国甘蓝型油菜基因组序列和注释文件,结合不育、可育花蕾的转录组测序数据进行分析,对候选区间内的基因进行GO富集、KEGG分析、q RT-PCR及功能注释来筛选候选基因,同时对候选基因进行克隆以及生物信息学分析,结果如下:1.育性遗传规律分析将纯合两型系WSLA与WSLB在田间进行杂交,统计兄妹交子代群体中不育株和可育株的数目,其中2020年共统计兄妹交子代群体112株,其中不育株61株,可育株51株,2021年共统计兄妹交子代群体134株,其中不育株73株,可育株61株,2022年共统计兄妹交子代群体658株,其中不育株343株,可育株315株,经卡方检验,三年所统计的育性分离比例均符合1:1的理论值(χ2c<χ20.05),并观察到群体的育性分离不受环境影响。初步分析确认纯合两型系的育性符合孟德尔隐性纯合基因遗传模式,属于质量性状。2.不育基因候选区间的染色体定位采用BSA法,利用纯合两型系不育亲本WSLA和可育亲本WSLB兄妹交的子代分离群体,构建不育和可育的叶片DNA子代池,进行深度30×重测序,以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh和本研究小组所培育的甘蓝型黄籽油菜作为参考基因组,与重测序数据进行比对,通过Mutmap+、QTL＿seq R流程分析,将不育基因定位在了C09染色体末端,物理区间为43-46Mb。3.SSR分子标记开发利用MISA软件识别纯合两型系WSLAB不育基因候选区间C09:43-46Mb内的微卫星和复合微卫星序列,并运用命令行引物设计软件Primer3来快速高效批量的在候选区间内设计SSR引物,共设计出42对SSR引物。42对SSR引物分别对不育和可育的叶片DNA进行PCR扩增,经验证获得4个有稳定多态性的SSR标记。4.InDel分子标记开发利用samtools软件截取不育亲本和不育子代池及可育亲本和可育子代池于不育基因候选区间C09:43-46Mb的bam文件,将其导入碱基可视化软件IGV,查询候选区间内不育亲本、不育子代池和可育亲本、可育子代池间的InDel变异位点,并设计InDel引物,共设计出21对InDel引物。将这21对InDel引物对不育和可育的叶片DNA进行PCR扩增,经验证获得2个有稳定多态性的InDel标记。5.候选基因分析构建纯合两型系分离群体的不育花蕾和可育花蕾的RNA混池,设置2个生物学重复进行转录组测序,得到287个差异表达基因,其中在候选区间内的共有28个。对28个差异表达基因进行聚类分析和拟南芥同源序列比对及功能注释,基因BnaC09g45810D与拟南芥AT5G10650同源,功能注释为RING/U-box superfamily protein,该家族蛋白质在拟南芥中涉及到了细胞的许多过程如:细胞程序性死亡,细胞周期调节,蛋白质的降解等。对候选区间内的28个差异表达基因进行GO富集和KEGG分析,基因BnaC09g45810D被富集到自噬作用中,参与细胞的自噬过程,通过q RT-PCR对BnaC09g45810D进行定量分析,结果显示该基因的表达量在不育的花蕾和雄蕊部位显著低于可育的花蕾和雄蕊部位,基于上述分析,本研究推测基因BnaC09g45810D为纯合两型系不育候选基因。6.候选基因克隆和生物信息学分析对不育候选基因BnaC09g45810D进行克隆,经过序列比对发现,BnaC09g45810D在不育材料和可育材料的核酸序列中仅存在1个碱基的差异,并引起了氨基酸的变化。对不育候选基因BnaC09g45810D的编码蛋白进行生物信息学分析,发现在不育材料和可育材料中都是亲水性蛋白质且不属于跨膜蛋白或分泌蛋白。不育材料中基因BnaC09g45810D所编码的蛋白质有46个磷酸化位点,它的二级结构有19.07%的α-螺旋,46.78%的无规则卷曲,23.28%的延伸链结构,10.86%的β-转角。可育材料中基因BnaC09g45810D所编码的蛋白质同样有46个磷酸化位点,其二级结构有19.25%的α-螺旋,46.46%的无规则卷曲,24.12%的延伸链结构,10.18%的β-转角,在所预测的蛋白质三级结构模型中二者并无显著差异。
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