常规超声联合超声造影与多层螺旋CT对直肠肿瘤诊断的对比研究

这是一篇关于超声检查,超声造影,微泡,直肠肿瘤,多层螺旋CT的论文, 主要内容为目的：结直肠疾病是比较常见的消化系统疾病，近些年直肠癌的发病率有上升趋势，已经成为常见的恶性肿瘤之一，因患者早期多无症状，确诊时多为晚期，故术前对直肠癌的正确分期是治疗的关键所在。经直肠腔内超声（TRUS）具有高的分辨率，可以实时动态观察病灶，是临床常用的术前分期以及术后评估的重要检查方法[1]。通过彩色多普勒超声可以分析肿瘤内血管情况，测量肿瘤内动脉收缩期峰值流速（PSV）、舒张末期流速（EDV）及阻力指数（RI），联合血流动力学特征及常规二维声像图表现鉴别肿瘤的良、恶性。超声造影技术可清晰显示组织微循环血流灌注情况，增加图像对比分辨率，可以进一步评估肿物的良恶性。本研究旨在探讨常规超声技术联合经直肠超声造影对直肠肿瘤的诊断价值。 方法：选取2011年10月-2012年11月在河北医科大学第四医院外二科行手术切除的直肠肿瘤患者91例，年龄20-82岁，平均62.8±11.4岁，其中直肠癌57例（男性32例女性25例），直肠腺瘤34例（男性21例女性13例）。 对所有的直肠肿瘤患者行经直肠常规二维超声检查观察病变特点及彩色血流信号：选取清晰动脉分别测量动脉收缩期峰值流速（PSV）、舒张末期流速（EDV）及阻力指数（RI），存图待分析。根据血流信号的分布、走行，将肿物血管分为4级：0级-肿物内部及周边未见血流信号；1级-少量血流，肿物周边及内部可见1-2处短条状血流分布，；2级-中量血流，肿物内部看见清晰的血管，走形较平直；3级-血流丰富，肿物内部可见丰富的血流信号，走行迂曲不规则，周边可见血管包绕。 该研究91例病例中除外不适合超声造影的患者，剩余46例患者（其中男性26例，女性20例，年龄20-77岁，平均56.1±13.2岁）行经直肠超声造影：采用Sono Vue造影剂静脉团注法，选取病变的最佳切面，观察病灶增强方式、强化特点，再对图像进行定量分析，绘制正常肠壁与直肠病变感兴趣区域血流灌注时间-强度曲线（TIC），分析各造影参数。 91例病例中手术前同时行TRUS及多层螺旋CT（MSCT）检查的患者共68例（其中男性37例，女性31例，年龄32-74岁，平均55.2±10.3岁），MSCT检查方法为运用西门子螺旋扫描仪，扫描范围从膈顶至盆底，病灶段为薄层扫描，必要时行增强扫描。由2名主治医生对图像进行TNM分期，分析肿物性质、浸润深度及直肠周围脏器转移、浸润程度，同时对周边淋巴结的数目、大小分布进行分析。 结果： 1病理结果直肠癌57例（其中：腺癌32例，黏液腺癌21例，印戒细胞癌3例，恶性间质瘤1例）。直肠腺瘤34例（其中：管状腺瘤18例，绒毛状腺瘤9例，管状绒毛状腺瘤4例，绒毛状腺瘤不典型增生2例，管状腺瘤不典型增生1例）。 2直肠良恶性肿瘤的常规超声表现 2.1常规二维超声表现：34例直肠腺瘤超声所示均可见肿物自黏膜层向肠腔隆起，呈赘生性生长，类圆形或乳头状，部分可见蒂，直径约1.4cm-4.7cm，呈稍强回声，内部回声尚均匀，探头触之可移动；57例直肠癌多数表现为低回声团块，内部回声不均，呈隆起型或溃疡型，形态不规则，侵及长度范围约1.7cm-6.9cm,向直肠壁各层浸润，其中38例可见直肠周围淋巴结肿大，21例可见侵及邻近器官，4例有肝转移。2.2直肠良恶性肿瘤的血流灌注形态、分布：直肠腺瘤血管走形规则，形态单一，表现为自蒂部发出一主干，向瘤体内呈辐射状分布，根据AdlerDD提出的血流分级标准，血流分级以0-1级为主，其中0级11例，Ⅰ级16例，Ⅱ级7例。直肠癌血管分布杂乱，形态多样，走形迂曲，血管分级以2-3级为主。其中0级0例，Ⅰ级11例，Ⅱ级20例，Ⅲ级26例。上述结果经统计学分析有统计学意义（x2=40.991，P＜0.01）。2.3直肠良恶性肿瘤的血流动力学指标：选择直肠良恶性肿物内CDFI可清晰显示的动脉血流，PW测量其PSV、EDV及RI。直肠腺瘤PSV：14.15±3.40cm s EDV：4.62±0.53cm s RI：0.63±0.03；直肠癌PSV：18.64±2.51cm s EDV：4.72±1.98cm s RI：0.74±0.10。结果显示直肠癌动脉血流频谱为高阻型，直肠腺瘤内动脉血流频谱为低阻型，二者经统计学分析有显著差异（P＜0.05）。3TRUS与MSCT对肿瘤浸润深度（T分期）比较结果，TRUS诊断T分期的符合率为76.4%（52/68）；MSCT诊断T分期的符合率为58.8%（40/68）。TRUS对判断T分期的准确性高于MSCT。 4直肠良恶性肿瘤的超声造影表现 4.1直肠良性病灶造影表现：注射造影剂后表现为与周围肠壁几乎同步增强、同步消退，达峰时呈等增强，增强方式表现为较均匀一致。 4.2直肠癌超声造影模式：注射造影剂后病灶表现为快速充盈快速消退，早期造影剂迅速填充整个肿物，小部分表现为均匀增强，部分呈不均匀增强；造影晚期表现为快速下降，以病灶中心明显，中心呈低增强，周边呈稍强增强。 4.3通过分析TIC曲线得出达峰时间、峰值强度和曲线下面积在良恶性组间、正常肠壁和恶性组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），良性组在大体观察上与周围肠壁几乎同步增强，但TIC曲线获得的达峰时间较正常肠壁缩短，二者比较有统计学意义（P＜0.05），平均通过时间在正常肠壁和恶性组间、良性组与正常肠壁组间比较有统计学意义（P＜0.05）。 4.4常规超声联合超声造影在诊断直肠病灶方面敏感性、特异性及准确性分别为100%、87%及97%，明显高于常规超声。 结论： 1直肠肿物内血流分布、分级以及血流动力学指标均可为肿物的性质提供参考意见。 2在直肠癌术前分期的诊断符合率方面，TRUS明显优于MSCT。 3本研究通过对直肠肿物进行超声造影，以术后病理分组讨论，恶性肿瘤的峰值强度、达峰时间及曲线下面积高于良性肿瘤及周围正常肠壁，差异有统计学意义；良性肿瘤与周围正常肠壁之间在峰值强度、曲线下面积方面无统计学意义，在与正常肠壁达峰时间上比较有统计学意义；平均通过时间在正常肠壁和恶性组间、良性组与正常肠壁组间比较有统计学意义。超声造影在进一步鉴别肿物良恶性方面提供了更直观的依据。 4常规超声联合超声造影通过对敏感性、特异性及准确性方面的比较，明显高于常规超声，证实对于直肠肿瘤常规超声是诊断的基础，超声造影是对常规超声的补充，二者联合检查可以明显提高诊断效果。

超声肿瘤血流效应增强化疗机制及安全性研究

这是一篇关于超声,微泡,空化效应,化疗,肿瘤转移的论文, 主要内容为研究背景:近年来,超声靶向微泡破坏(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)在超声治疗领域的应用和研究不断深入和强化。前期实验发现UTMD辅助化疗能够使靶区肿瘤药物浓度明显增加,有效抑制肿瘤生长,进而延长实验动物的生存期。此外,诊断超声联合微泡增强吉西他滨对胰腺癌的治疗效果也在临床试验中得到验证,实现了患者生存期的延长。超声增强肿瘤化疗的机制尚不完全清楚,可能有两个影响因素:首先是由于微泡空化效应对肿瘤微血管壁的损伤作用导致的炎症反应,具有扩血管作用的炎症因子释放,导致肿瘤微循环血流量的增加和释药增加;其次是超声空化效应导致的声孔效应,对薄弱的肿瘤血管可能造成机械性打孔损伤,在管壁上形成可逆性的微孔隙,血管通透性增高,从而提高靶区化疗释药浓度。然而血管扩张、血流增强和通透性增高可能增加肿瘤转移的风险,阻碍其临床应用。关于超声联合微泡对肿瘤转移的影响研究较少,而诊断级超声联合微泡增强肿瘤化疗对转移的影响更是鲜为报道。故本课题在前期实验结果基础上,通过改进VINNO 70超声诊疗一体机,对超声肿瘤血流效应增强化疗释药、机制以及转移风险进行深入研究。研究目的:1.通过改进的超声诊疗一体机,对超声联合微泡增强肿瘤组织血流效应以及提高局部药物浓度进行量化评估。2.初步探究超声联合微泡增强化疗的机制。3.观察超声联合微泡增强化疗对肿瘤生长抑制、远期多脏器转移及生存期的影响,评估该技术的有效性及可行性。材料和方法:1、主要实验仪器1.1 VINNO 70超声诊疗一体机(飞依诺科技有限公司,苏州),线阵探头X4-12L。VINNO 70超声机采用治疗脉冲与诊断脉冲交替发射的VFlash治疗模式,改进后的超声机能从脉冲重复频率(Pulse repetition frequency,PRF)等多个参数调控机械指数(Mechanical index,MI),调控超声空化,并能使超声能量在感兴趣区(Region-of-interest,ROI)内实现电子弱聚焦。1.2 ECARE超声机(医凯电子科技有限公司,珠海),其治疗脉冲与诊断脉冲完全穿插发射。1.3 Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统(富士Visual Sonics公司,加拿大),利用21 MHz线阵探头进行二维扫查。2、主要实验试剂2.1造影剂:“脂氟显”脂质微泡造影剂,声诺维?造影剂;2.2盐酸阿霉素。3、实验动物新西兰大白兔4、实验方法实验一:超声肿瘤血流增强效应促进化疗释药及机制研究(1)VINNO 70微泡击破实验超声造影显示及峰值负压(Peak negative pressure,PNP)水听器测量。(2)33只新西兰大白兔VX2荷瘤兔随机分为3组,每组11只:单纯化疗组,VINNO超声治疗组1(PRF=1000 Hz,MI=0.29),VINNO超声治疗组2(PRF=500 Hz,MI=0.34)。所有实验兔在实验前后均造影。所有实验兔均接受阿霉素化疗10 min,化疗结束后超声治疗组接受超声联合微泡治疗20 min,单纯化疗组仅接受化疗。(3)测量指标:治疗前后峰值强度、曲线下面积、灌注面积;高效液相色谱法、冰冻切片阿霉素荧光强度;电镜;活性氧(Reactive oxygen species,ROS)荧光强度。实验二:超声化疗对肿瘤转移及生存期的影响(1)44只荷瘤兔随机分为3组,对照组(n=16),VINNO超声治疗组(MI=0.29)(n=17),ECARE超声治疗组(MI=0.33)(n=11)。均接受3次阿霉素化疗10 min,化疗结束后超声治疗组接受超声联合微泡治疗10 min,单纯化疗组仅接受化疗。(2)测量指标:肿瘤生长率;实验兔生存期;肝、肺、脑及肾转移情况;各转移灶及原发肿瘤HE染色结果。结果实验一:超声肿瘤血流增强效应促进化疗释药及机制研究(1)VINNO 70超声测量:VINNO 70治疗模式下,ROI区域内微泡被击破,ROI外微泡相对未受影响。在距探头2cm及5cm处,水听器实测MI值与显示MI值有一定差距,因此有必要对参数进行实际校正。(2)血流效应:治疗前后灌注面积、峰值强度及曲线下面积皆表明超声治疗后即时血流增强,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)肿瘤组织药物浓度:高效液相色谱法测量药物浓度,超声治疗组1药物浓度为对照组2.63倍,治疗组2药物浓度为对照组2.07倍(P<0.05)。冰冻切片观察阿霉素荧光,超声治疗组明显强于对照组。(4)超声联合微泡增强化疗机制分析:超声治疗组ROS平均荧光强度明显强于对照组(P<0.01)。电镜观察可见对照组血管结构完整,治疗组1血管基底膜破坏更彻底,而治疗组2血管基底膜部分保留。实验二:超声化疗对肿瘤转移及生存期的影响(1)转移情况:各组间转移评级及单器官转移灶均无明显统计学差异(P>0.05)。(2)肿瘤生长率:第3天时,各组肿瘤生长率无统计学差异(P>0.05);第5天时,超声治疗组肿瘤生长率均明显低于对照组(P<0.01)。(3)生存曲线:VINNO超声治疗组>ECARE超声治疗组>对照组,但各组间无统计学差异(P>0.05)。结论1.超声联合微泡能有效提高兔VX2肿瘤血流灌注,显著增加肿瘤局部平均化疗药物浓度。其作用机制可能是超声空化效应导致的血管壁通透性增加及局部炎症反应。2.超声联合微泡增强化疗对肿瘤生长具有抑制作用,且未增加VX2肿瘤多脏器转移风险,对动物生存期不具有显著影响。

超声肿瘤血流效应增强化疗机制及安全性研究

这是一篇关于超声,微泡,空化效应,化疗,肿瘤转移的论文, 主要内容为研究背景:近年来,超声靶向微泡破坏(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)在超声治疗领域的应用和研究不断深入和强化。前期实验发现UTMD辅助化疗能够使靶区肿瘤药物浓度明显增加,有效抑制肿瘤生长,进而延长实验动物的生存期。此外,诊断超声联合微泡增强吉西他滨对胰腺癌的治疗效果也在临床试验中得到验证,实现了患者生存期的延长。超声增强肿瘤化疗的机制尚不完全清楚,可能有两个影响因素:首先是由于微泡空化效应对肿瘤微血管壁的损伤作用导致的炎症反应,具有扩血管作用的炎症因子释放,导致肿瘤微循环血流量的增加和释药增加;其次是超声空化效应导致的声孔效应,对薄弱的肿瘤血管可能造成机械性打孔损伤,在管壁上形成可逆性的微孔隙,血管通透性增高,从而提高靶区化疗释药浓度。然而血管扩张、血流增强和通透性增高可能增加肿瘤转移的风险,阻碍其临床应用。关于超声联合微泡对肿瘤转移的影响研究较少,而诊断级超声联合微泡增强肿瘤化疗对转移的影响更是鲜为报道。故本课题在前期实验结果基础上,通过改进VINNO 70超声诊疗一体机,对超声肿瘤血流效应增强化疗释药、机制以及转移风险进行深入研究。研究目的:1.通过改进的超声诊疗一体机,对超声联合微泡增强肿瘤组织血流效应以及提高局部药物浓度进行量化评估。2.初步探究超声联合微泡增强化疗的机制。3.观察超声联合微泡增强化疗对肿瘤生长抑制、远期多脏器转移及生存期的影响,评估该技术的有效性及可行性。材料和方法:1、主要实验仪器1.1 VINNO 70超声诊疗一体机(飞依诺科技有限公司,苏州),线阵探头X4-12L。VINNO 70超声机采用治疗脉冲与诊断脉冲交替发射的VFlash治疗模式,改进后的超声机能从脉冲重复频率(Pulse repetition frequency,PRF)等多个参数调控机械指数(Mechanical index,MI),调控超声空化,并能使超声能量在感兴趣区(Region-of-interest,ROI)内实现电子弱聚焦。1.2 ECARE超声机(医凯电子科技有限公司,珠海),其治疗脉冲与诊断脉冲完全穿插发射。1.3 Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统(富士Visual Sonics公司,加拿大),利用21 MHz线阵探头进行二维扫查。2、主要实验试剂2.1造影剂:“脂氟显”脂质微泡造影剂,声诺维?造影剂;2.2盐酸阿霉素。3、实验动物新西兰大白兔4、实验方法实验一:超声肿瘤血流增强效应促进化疗释药及机制研究(1)VINNO 70微泡击破实验超声造影显示及峰值负压(Peak negative pressure,PNP)水听器测量。(2)33只新西兰大白兔VX2荷瘤兔随机分为3组,每组11只:单纯化疗组,VINNO超声治疗组1(PRF=1000 Hz,MI=0.29),VINNO超声治疗组2(PRF=500 Hz,MI=0.34)。所有实验兔在实验前后均造影。所有实验兔均接受阿霉素化疗10 min,化疗结束后超声治疗组接受超声联合微泡治疗20 min,单纯化疗组仅接受化疗。(3)测量指标:治疗前后峰值强度、曲线下面积、灌注面积;高效液相色谱法、冰冻切片阿霉素荧光强度;电镜;活性氧(Reactive oxygen species,ROS)荧光强度。实验二:超声化疗对肿瘤转移及生存期的影响(1)44只荷瘤兔随机分为3组,对照组(n=16),VINNO超声治疗组(MI=0.29)(n=17),ECARE超声治疗组(MI=0.33)(n=11)。均接受3次阿霉素化疗10 min,化疗结束后超声治疗组接受超声联合微泡治疗10 min,单纯化疗组仅接受化疗。(2)测量指标:肿瘤生长率;实验兔生存期;肝、肺、脑及肾转移情况;各转移灶及原发肿瘤HE染色结果。结果实验一:超声肿瘤血流增强效应促进化疗释药及机制研究(1)VINNO 70超声测量:VINNO 70治疗模式下,ROI区域内微泡被击破,ROI外微泡相对未受影响。在距探头2cm及5cm处,水听器实测MI值与显示MI值有一定差距,因此有必要对参数进行实际校正。(2)血流效应:治疗前后灌注面积、峰值强度及曲线下面积皆表明超声治疗后即时血流增强,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)肿瘤组织药物浓度:高效液相色谱法测量药物浓度,超声治疗组1药物浓度为对照组2.63倍,治疗组2药物浓度为对照组2.07倍(P<0.05)。冰冻切片观察阿霉素荧光,超声治疗组明显强于对照组。(4)超声联合微泡增强化疗机制分析:超声治疗组ROS平均荧光强度明显强于对照组(P<0.01)。电镜观察可见对照组血管结构完整,治疗组1血管基底膜破坏更彻底,而治疗组2血管基底膜部分保留。实验二:超声化疗对肿瘤转移及生存期的影响(1)转移情况:各组间转移评级及单器官转移灶均无明显统计学差异(P>0.05)。(2)肿瘤生长率:第3天时,各组肿瘤生长率无统计学差异(P>0.05);第5天时,超声治疗组肿瘤生长率均明显低于对照组(P<0.01)。(3)生存曲线:VINNO超声治疗组>ECARE超声治疗组>对照组,但各组间无统计学差异(P>0.05)。结论1.超声联合微泡能有效提高兔VX2肿瘤血流灌注,显著增加肿瘤局部平均化疗药物浓度。其作用机制可能是超声空化效应导致的血管壁通透性增加及局部炎症反应。2.超声联合微泡增强化疗对肿瘤生长具有抑制作用,且未增加VX2肿瘤多脏器转移风险,对动物生存期不具有显著影响。

载SDF-1α脂质纳米粒—声诺维?复合体的制备及特性研究

这是一篇关于脂质纳米粒-声诺维复合体,微泡,低强度聚焦超声,水溶性蛋白控释,药物递送的论文, 主要内容为目的:制备一种粒径为纳米级,分布均一,且能稳定缓释SDF-1α的脂质纳米粒(SDF-1αlipid nanoparticles,SNP)。将SNP和声诺维(Sono Vue?)制备成一种兼具缓释作用和超声显像功能的载SDF-1α脂质纳米粒-声诺维复合体(SNP-Sono Vue?)。检测其结构和生物活性,构建超声辐照持续稳定释药的给药模型,以实现局部的控释给药和体内药物示踪。方法:SNP的制备。按10:4:3.5:3.5称取一定量的DPPC,DSPE,DPPG,DC-胆固醇制备SNP,采用微量滴加-冻干法制备带正电荷、油包水结构的纳米级SNP。马尔文粒径测量仪测量SNP的粒径大小和zeta电位,白光显微镜和透射电镜观察SNP的微观形态,ELISA测定SNP对SDF-1α的包封率。SNP-Sono Vue?的制备。构建SNP-Sono Vue?,流式细胞术筛选构建SNP-Sono Vue?的适宜比例。分别于1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、40 h、80 h、144 h用ELISA测定SNP和LIFU辐照后SNP-Sono Vue?在PH=7.4的PBS缓冲液中的缓释情况,绘制SNP和SNP-Sono Vue?的释药曲线。荧光显微镜观察复合体中Sono Vue?微泡对SNP的携带情况。SNP-Sono Vue?生物活性及体外显像的观察:将BMSCs用无血清培养基悬浮后,以2×105个/ml接种于Transwell小室膜上,根据下室培养基的组成分为6组。A组:SDF-1α+1%血清培养基;B组:SNP-Sono Vue?+1%血清培养基;C组:LIFU辐照后SNP-Sono Vue?+1%血清培养基(频率1MHz,声强0.5W/cm2,辐照时间为辐照30s停30s,作用4min);D组:BNP-Sono Vue?+1%血清培养基;E组:LIFU辐照后BNP-Sono Vue?+1%血清培养基(频率1MHz,声强0.5W/cm2,辐照时间为辐照30s停30s,作用4min);F组:PBS+1%血清培养基(对照组)。观察SNP、SNP-Sono Vue?及LIFU辐照后SNP-Sono Vue?的生物活性。制作琼脂糖凝胶模型,分别吸取1 ml SNP和1 ml SNP-Sono Vue?置于制备好的琼脂糖模具中,观察其体外超声显影的情况。结果:1.制得的SNP平均粒径为(220.4±9.9)nm,PDI为0.172±0.015,平均电位为(35.6±1.7)m V。普通显微镜下可见SNP大小均一,分散均匀。透射电镜下可见SNP呈均匀分散的球形,无聚集成团现象,药物包封率为96.7%,载药量为481.76 ng/mg。2.流式细胞术分析可见SNP质量(mg)与Sono Vue?微泡(个)的比值为20:(2.8×109)40:(2.8×109)是SNP-Sono Vue?制备的适宜条件。荧光显微镜显示复合体中的Sono Vue?微泡外壳有大量的Di I标记的带红色荧光SNP。在药物缓释实验中,根据ELISA计算出药物释药率绘制出释药曲线,可见LIFU辐照后SNP及SNP-Sono Vue?在7 d内SNP能以稳定的速度释药,药物释放率分别为(68.61±3.97)%和(63.21±5.68)%。两组之间的药物释放曲线的差异无统计学意义。3.细胞迁移实验证实SDF-1α组和SNP-Sono Vue?组及LIFU辐照后SNP-Sono Vue?组对BMSCs的迁移作用明显强于对照组,但SDF-1α组、SNP-Sono Vue?组及LIFU辐照后SNP-Sono Vue?组间无明显差异。体外显影实验可见SNP-Sono Vue?复合体有明显增强显影作用。结论:本研究将缓释脂质纳米粒和超声微泡结合,成功制备了一种兼具缓释作用和超声显影作用的SNP-Sono Vue?,通过超声辐照后可持续稳定释药,为水溶性药物及水溶性蛋白质的运载及定点控释提供了新思路和新手段。

超声波辐照联合微泡助溶血栓的体外实验研究

这是一篇关于超声,微泡,血栓,溶栓的论文, 主要内容为目的:1.模拟体外流动模型,观察超声波辐照联合微泡在血栓溶解中的作用,评估超声波辐照增强血栓溶解效果。2.在体外实验中对比自制脂质微泡(microbubbles,MBs)与Sono Vue的血栓溶解差异,观察不同类型微泡对血栓溶解的影响。3.在体外实验中对比观测37℃与41℃不同环境温度的血栓溶解差异,了解温度对体外血栓溶解的影响。4.在体外实验中对比新鲜血栓与回缩血凝块的血栓溶解差异,了解超声波辐照联合微泡在不同栓龄血栓中的溶解作用。方法:1.脂质微泡的制备:二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙胺(DSPE-PEG)、甘油、全氟丙烷,通过机械震荡法制备脂质微泡。2.血栓制备:1新鲜血栓:用枸橼酸真空采血管抽取健康志愿者全血,氯化钙溶液促进血液凝固,放入37℃温浴箱温浴3h后,将血栓放入4℃冰箱储存3h。2回缩血凝块:用枸橼酸真空采血管抽取健康志愿者全血,氯化钙溶液促进血液凝固,37℃温浴箱温浴3h后,在4℃冰箱储存7d,7d后取出试管,将半透明的血清从血凝块中分离,以获得稳定的回缩血凝块。3.体外循环装置:由密闭模拟血管管道、恒温水浴箱、微量蠕动泵、药物注入通道组成。整个实验过程密闭管道置于恒温水浴中,循环管道流速控制在4.5ml/s,超声波辐照探头置于血栓垂直正上方5cm处固定。4.实验分组:按超声波辐照、微泡、尿激酶、环境温度以及血栓栓龄的不同组合,随机分为1个对照组、6个实验组,每组10个样本,超声波辐照参数统一设定为频率1MHz,强度2w/cm2,占空比50%。A组:超声波假辐照20min,生理盐水2ml,水浴温度37℃,新鲜血栓。B组:超声波辐照20min,MBs 1ml,生理盐水1ml,水浴温度37℃,新鲜血栓。C组:超声波辐照20min,尿激酶1ml,生理盐水1ml,水浴温度37℃,新鲜血栓。D组:超声波辐照20min,MBs 1ml,尿激酶1ml,水浴温度37℃,新鲜血栓。E组:超声波辐照20min,Sono Vue 1ml,尿激酶1ml,水浴温度37℃,新鲜血栓。F组:超声波辐照20min,MBs 1ml,尿激酶1ml,水浴温度41℃,新鲜血栓。G组:超声波辐照20min,MBs 1ml,尿激酶1ml,水浴温度37℃,回缩血凝块。5.应用西门子ACUSON SC2000超声诊断仪和L9-1超声探头测量狭窄率和血栓面积。观察指标:血栓溶解前后的血栓重量损失率、血栓溶解前后体外循环管道的血栓放置部位管腔狭窄率、血栓溶解前后的血栓最大长轴切面面积减少率。6.统计学处理:七组的测量数据经正态性检验均服从正态分布(P>0.05),方差同质性检验,方差齐(P>0.05),七组的各变量均为连续性数值变量,各组变量以均值±标准差()表示,七组间整体比较采用单因素方差分析,评价七组血栓溶解效果的整体趋势及差异;两两间比较采用LSD-t分析,进行超声波辐照联合微泡、微泡类型、温度、栓龄分别对血栓溶解作用的分析。均以P<0.05为具有统计学意义。所有数据均采用SPSS 21.0统计软件进行分析。结果:1.七组血栓溶解前后重量损失率、面积减少率及管腔狭窄率改变,各组间整体比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。2.A组与B组:血栓溶解前后重量损失率、面积减少率差异具有显著统计学意义(P<0.01),重量损失率从3%增加到10%,同比增高233%,面积减少率从2%增加到7%,同比增高250%,管腔狭窄率的比较无显著统计学差异(P>0.05)。3.C组与D组:血栓溶解前后重量损失率、面积减少率差异具有显著统计学意义(P<0.01),重量损失率从15%增加到16%,同比增高7%,面积减少率从10%增加到14%,同比增高40%,管腔狭窄率的比较无显著统计学差异(P>0.05)。4.D组与E组:血栓溶解前后重量损失率、面积减少率及管腔狭窄率差异均具有显著统计学意义(P<0.01),重量损失率从16%增加到21%,同比增高31%,面积减少率从14%增加到25%,同比增高79%,管腔狭窄率从6%增加到12%,同比增高100%。5.D组与F组:血栓溶解前后重量损失率、面积减少率及管腔狭窄率差异均具有显著统计学意义(P<0.01),重量损失率从16%增加到29%,同比增高81%,面积减少率从14%增加到31%,同比增高121%,管腔狭窄率从6%增加到13%,同比增高117%。6.G组与A组:血栓溶解前后重量损失率、面积减少率及管腔狭窄率无显著统计学差异(P>0.05)。7.G组与D组:血栓溶解前后重量损失率、面积减少率及管腔狭窄率差异均具有显著统计学意义(P<0.01),重量损失率从2%增加到16%,同比增高700%,面积减少率从2%增加到14%,同比增高600%,管腔狭窄率从3%增加到6%,同比增高200%。结论:1.本实验初步证明,在体外模拟血管血液流动模型中,超声波辐照(f=1MHz,P=2.0w/cm2,占空比50%)联合微泡可促进血栓溶解。2.Sono Vue与自制脂质微泡均能增强血栓溶解,Sono Vue作用更为显著。3.体外血栓溶解中,温度的改变影响新鲜血栓溶解,温度升高可显著增强血栓溶解。4.微泡介导的超声增强尿激酶溶栓,受栓龄的影响明显,不能有效促进回缩血凝块溶解。

单纯低频超声及微泡联合超声辐照对大鼠后肢血管通透性影响的实验研究

这是一篇关于微泡,超声,伊文思蓝,血管通透性,内皮细胞屏障的论文, 主要内容为目的:1,研究单纯低频超声辐照对大鼠后肢血管通透性的影响。2,研究低频超声辐照联合微泡造影剂(Sono Vue)对大鼠后肢血管通透性的影响。3,研究超声辐照对内皮细胞活性的影响。4,研究超声辐照对体外内皮细胞屏障模型通透性和紧密连接ZO-1蛋白的影响。方法:1,72只清洁级SD雄性大鼠随机分为9组,每组8只大鼠,分别为空白组、2.5min组、5min组、10min组、20min组、30min组、40min组、60min组和120min组,其中8个时间组为单纯超声辐照亚组,分组依据为超声辐照与伊文思蓝注射所间隔的时间。检测伊文思蓝的外渗含量对大鼠肢体血管的通透性进行定量分析。每组随机选取2只大鼠行组织样本的苏木精-伊红染色。2,80只清洁级SD雄性大鼠随机分为8组,每组10只大鼠,分别为空白组、单纯微泡组、2.5min组、5min组、10min组、20min组、30min组和60min组,其中6个时间组为微泡+超声亚组,分组依据为超声辐照与伊文思蓝注射所间隔的时间。检测伊文思蓝(Evans Blue,EB)的外渗含量对大鼠后肢的血管通透性进行定量分析。每组随机选取2只大鼠分别行透射电镜检测和苏木精-伊红染色。3,HUVECs细胞经超声辐照后通过MTS实验检测单纯超声或微泡联合超声辐照对细胞活力的影响。4,单纯超声实验和微泡联合超声实验均设置一系列时间组,包括0.5H、1H、2H、4H、8H和24H组,分组依据为超声辐照与实验检测所间隔的时间。通过MTS实验和LDH实验评价超声辐照对HUVECs细胞活力的影响。通过FITC-Dextran的跨膜实验评价超声辐照对内皮细胞屏障通透性的影响。通过蛋白印记和免疫荧光实验检测超声辐照对HUVECs细胞内紧密连接蛋白ZO-1表达和分布的影响。结果:1,单纯低频超声辐照能够改变大鼠肢体血管的通透性。血管通透性于超声辐照30min后显著增强,而于超声辐照120min后通透性恢复至正常状态。单纯超声辐照对超声作用区域的血管和肌肉组织无损伤。2,微泡联合低频超声辐照能够改变大鼠肢体血管的通透性。通透性增强的最佳时间窗为超声辐照后30min内,而在超声辐照1h后血管通透性恢复至正常状态。HE切片观察未见超声辐照区域内的血管和肌肉组织损伤。超声辐照联合微泡能够打开动脉内皮细胞间紧密连接结构。3,单纯低频超声辐照对HUVECs细胞的增殖有轻度抑制作用,但随着超声声压的增加和辐照时间的延长,细胞的生存率未受到显著影响。微泡联合超声辐照对HUVECs细胞的增殖存在显著的抑制作用,随着辐照时间的延长和微泡浓度的增加,细胞的生存率显著降低。但超声声压增加未对细胞的生存率产生显著影响。最佳的超声辐照条件是声压为0.4MPa的500k Hz超声辐照1min,最适微泡造影剂浓度为20%。4,在一定条件下,单纯超声和微泡联合超声辐照均对细胞无显著损伤。单纯超声和微泡联合超声辐照能够可逆的改变内皮细胞屏障的通透性。两种超声辐照方式均不改变ZO-1蛋白在细胞内的表达,但改变ZO-1蛋白在细胞膜上的分布。结论:1,单纯低频超声辐照能够导致大鼠后肢血管通透性发生延迟增强,且通透性的改变为安全可逆的。2,微泡联合低频超声辐照能够安全可逆的改变大鼠后肢血管的通透性。3,单纯低频超声辐照对HUVECs细胞的增殖无显著的抑制作用。微泡联合超声辐照对HUVECs细胞的增殖存在显著的抑制作用,随着辐照时间延长和微泡浓度增加,HUVECs细胞的生存率显著降低。最佳超声辐照条件是声压为0.4MPa的500k Hz超声辐照1min,最适的微泡浓度为20%。4,单纯超声和微泡联合超声辐照均能够安全可逆的改变内皮细胞屏障的通透性,其潜在的分子机制与ZO-1蛋白在细胞膜上的分布变化相关。

靶向超声造影在体定量评价大鼠移植后卵巢新生血管的研究

这是一篇关于超声检查,微泡,新生血管形成,生理学,大鼠的论文, 主要内容为目的:观察以抗苗勒管(AMH)激素靶向纳米泡(AMH-NB)为超声造影剂在体定量评价大鼠自体卵巢移植后新生血管密度的价值。方法:使用“薄膜水化法”和“亲和素-生物素法”制备AMH-NB并检测其基本物理特性。将自体卵巢移植于右侧腹股沟区,以建立大鼠自体卵巢移植模型,于术后第7天进行靶向(AMH-NB)、非靶向(N-NB),及声诺维(Sono Vue)超声造影,获得峰值强度(PI)、达峰时间(TTP)值。以免疫组织化学法测微血管密度(MVD),并对PI、TTP与MVD进行相关性分析。以免疫荧光分析AMH-NB是否进入组织间隙。结果:制备的AMH-NB、N-NB粒径分别为(622.67±33.65)nm、(473.33±28.02)nm,分布均匀,浓度分别为(2.90±0.26)×108/m L、(3.5±0.20)×108/m L。AMH-NB超声造影显示卵巢PI为(7.93±0.65)d B,TTP为(42.53±1.74)s;N-NB超声造影卵巢PI值为(6.14±0.44)d B,TTP为(54.35±1.73)s;声诺维造影PI为(4.15±0.83)d B,TTP为(28.71±1.18)s,(P<0.05)。免疫组织化学分析显示移植后卵巢微血管密度为(61.20±6.84)/HP,组织学分析AMH-NB可穿过血管内皮细胞间隙进入组织间隙并与AMH结合。AMH-NB造影所示PI、TTP与MVD呈高度相关(r=0.84,r=-0.84,P<0.05)。Sonovue组(r=0.67,r-=-0.71,P<0.05)、N-NB组(r=0.65,r-=-0.68,P<0.05)造影所见PI、PPT分别于MVD呈中度相关。结论:利用AMH-NB进行超声造影可实现定性、定量评价大鼠移植后卵巢新生血管。

载SDF-1α脂质纳米粒—声诺维?复合体的制备及特性研究

这是一篇关于脂质纳米粒-声诺维复合体,微泡,低强度聚焦超声,水溶性蛋白控释,药物递送的论文, 主要内容为目的:制备一种粒径为纳米级,分布均一,且能稳定缓释SDF-1α的脂质纳米粒(SDF-1αlipid nanoparticles,SNP)。将SNP和声诺维(Sono Vue?)制备成一种兼具缓释作用和超声显像功能的载SDF-1α脂质纳米粒-声诺维复合体(SNP-Sono Vue?)。检测其结构和生物活性,构建超声辐照持续稳定释药的给药模型,以实现局部的控释给药和体内药物示踪。方法:SNP的制备。按10:4:3.5:3.5称取一定量的DPPC,DSPE,DPPG,DC-胆固醇制备SNP,采用微量滴加-冻干法制备带正电荷、油包水结构的纳米级SNP。马尔文粒径测量仪测量SNP的粒径大小和zeta电位,白光显微镜和透射电镜观察SNP的微观形态,ELISA测定SNP对SDF-1α的包封率。SNP-Sono Vue?的制备。构建SNP-Sono Vue?,流式细胞术筛选构建SNP-Sono Vue?的适宜比例。分别于1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、40 h、80 h、144 h用ELISA测定SNP和LIFU辐照后SNP-Sono Vue?在PH=7.4的PBS缓冲液中的缓释情况,绘制SNP和SNP-Sono Vue?的释药曲线。荧光显微镜观察复合体中Sono Vue?微泡对SNP的携带情况。SNP-Sono Vue?生物活性及体外显像的观察:将BMSCs用无血清培养基悬浮后,以2×105个/ml接种于Transwell小室膜上,根据下室培养基的组成分为6组。A组:SDF-1α+1%血清培养基;B组:SNP-Sono Vue?+1%血清培养基;C组:LIFU辐照后SNP-Sono Vue?+1%血清培养基(频率1MHz,声强0.5W/cm2,辐照时间为辐照30s停30s,作用4min);D组:BNP-Sono Vue?+1%血清培养基;E组:LIFU辐照后BNP-Sono Vue?+1%血清培养基(频率1MHz,声强0.5W/cm2,辐照时间为辐照30s停30s,作用4min);F组:PBS+1%血清培养基(对照组)。观察SNP、SNP-Sono Vue?及LIFU辐照后SNP-Sono Vue?的生物活性。制作琼脂糖凝胶模型,分别吸取1 ml SNP和1 ml SNP-Sono Vue?置于制备好的琼脂糖模具中,观察其体外超声显影的情况。结果:1.制得的SNP平均粒径为(220.4±9.9)nm,PDI为0.172±0.015,平均电位为(35.6±1.7)m V。普通显微镜下可见SNP大小均一,分散均匀。透射电镜下可见SNP呈均匀分散的球形,无聚集成团现象,药物包封率为96.7%,载药量为481.76 ng/mg。2.流式细胞术分析可见SNP质量(mg)与Sono Vue?微泡(个)的比值为20:(2.8×109)40:(2.8×109)是SNP-Sono Vue?制备的适宜条件。荧光显微镜显示复合体中的Sono Vue?微泡外壳有大量的Di I标记的带红色荧光SNP。在药物缓释实验中,根据ELISA计算出药物释药率绘制出释药曲线,可见LIFU辐照后SNP及SNP-Sono Vue?在7 d内SNP能以稳定的速度释药,药物释放率分别为(68.61±3.97)%和(63.21±5.68)%。两组之间的药物释放曲线的差异无统计学意义。3.细胞迁移实验证实SDF-1α组和SNP-Sono Vue?组及LIFU辐照后SNP-Sono Vue?组对BMSCs的迁移作用明显强于对照组,但SDF-1α组、SNP-Sono Vue?组及LIFU辐照后SNP-Sono Vue?组间无明显差异。体外显影实验可见SNP-Sono Vue?复合体有明显增强显影作用。结论:本研究将缓释脂质纳米粒和超声微泡结合,成功制备了一种兼具缓释作用和超声显影作用的SNP-Sono Vue?,通过超声辐照后可持续稳定释药,为水溶性药物及水溶性蛋白质的运载及定点控释提供了新思路和新手段。

超声微泡复合载体的制备及其效率研究—SonoVue与脂质体的耦联

这是一篇关于微泡,脂质体,超声,临界胶束浓度,戊二醛交联法,靶向载体的论文, 主要内容为背景与目的 超声造影剂是一种微气泡的混悬液,它在临床上的应用明显提高了超声诊断的敏感性和特异性。近年来,超声造影剂的研究发展非常迅速,是当前超声医学领域的研究热点之一。分子影像学的发展,使超声造影剂在靶向分子成像和靶向治疗方面显示出了很大的发展和应用潜力。 基因转移技术是疾病基因治疗的关键步骤,但是该技术在安全性、转移效率、靶向性等问题上一直未能有突破性进展。病毒载体虽然转移效率较高,但是其安全性问题不容忽视,相关报道发现病毒载体具有免疫源性和对宿主细胞基因的整合可能性;非病毒载体,具有安全、简单等优点,但是基因转移效率低,难以取得满意效果。脂质体和超声微泡是常用的非病毒基因转移载体之一,实验证明,超声辐照的方法可提高脂质体和微泡的基因转移效率,但是其效率和方式尚有待于进一步优化。 第二代超声造影剂,内充以高分子量、低溶解度的氟烷气体,使微泡在血液中稳定时间较长,其粒径仅数微米,经外周静脉注射后可自由通过组织器官的微循环,检测微泡所产生的超声信号,能得到组织血流灌注信息。目前多种商品化超声造影剂如Sono Vue,已逐渐在临床上广泛使用。通过在造影剂表面结合特异性配体实现病灶靶向显影,或利用微泡携带药物或基因以介导其靶向治疗,是第三代超声造影剂的发展方向。理想的微泡是能够同时具备良好的靶向显影和靶向治疗功能,以提高诊疗的特异性和准确性。实验证明,具有良好显影效果的微泡其粒径需达微米级别,但是这样大小的微粒无法穿透毛细血管壁,难以携带药物或基因进入肿瘤实质内发挥作用。为解决穿透力和显影效果之间的矛盾,我们将微米级微泡和纳米级脂质体耦联起来,以前者实现靶向显影功能,后者作为药物或基因运输载体,当该复合载体经血液循环靶向结合于靶标并得到病灶特异声像图后,超声波定向爆破微泡,便可释放纳米脂质体进入病灶实质。 本研究拟建立商品化造影剂Sono Vue和自制脂质体耦联的方法,并检测微泡携带脂质体的效率,为以脂质体-微泡复合载体作为靶向造影剂及药物载体的进一步体内实验甚至临床应用奠定基础。 方法 1.观察Sono Vue微泡的一般性质,用亲脂性荧光染料DiI对微泡进行标记,荧光显微镜和流式细胞仪检测DiI对脂质膜微泡的标记效果。 2.检测Sono Vue微泡脂质膜DSPE-PEG(2000)Amine的嵌入:通过流式细胞仪检测DSPE-PEG-FITC对Sono Vue微泡的标记效率,评价两亲性分子DSPE-PEG(2000)Amine嵌入脂质膜微泡壁的效率,并建立以这种方式对成品脂质膜微泡进行修饰的方法,为微泡添加可连接其它活性物质的桥梁。以生物素化Sono Vue微泡的对亲和素包被板的靶向结合实验,评价成品微泡可经修饰而具有靶向性。 3.脂质体与Sono Vue微泡的耦联:采用旋转蒸发-超声波法制备氨基化荧光脂质体,并用激光粒度仪测定脂质体粒径。二步法戊二醛交联脂质体和微泡,漂浮法洗涤后得到脂质体-微泡复合物。 4.流式细胞仪检测脂质体浓度对复合载体脂质体携带率的影响:每200μL的Sono Vue微泡混悬液内加入150μL的DSPE-PEG(2000)Amine(100μM),并以DSPE-PEG-FITC对微泡进行荧光标记,成为氨基化的荧光微泡;分别以0μL～300μL的浓度梯度加入戊二醛-脂质体(DiI标记)。流式细胞仪检测微泡的FITC和DiI双荧光阳性率,绘制并分析曲线图。 5.多功能酶标仪检测DSPE-PEG(2000)Amine浓度对复合载体脂质体携带率的影响:每200μL的Sono Vue微泡混悬液内加入0～250μL的DSPE-PEG(2000)Amine溶液(100μM),加入200μL戊二醛-脂质体(DiI标记),构建含不同量DSPE-PEG(2000)Amine的脂质体-微泡复合物,多功能酶标仪检测各组微泡荧光强度,并以脂质体荧光强度标准曲线计算各组微泡的脂质体携带率。 6.检测超声造影模式下的微泡时间-强度变化,以评价脂质体与微泡的耦联、微泡的氨基化对微泡显影功能的影响。 7.脂质体-微泡复合载体对体外培养细胞的作用:使MCF-7和SMMC-7721细胞与脂质体-微泡复合载体接触并经超声辐照,观察荧光脂质体进入细胞的情况,并与单脂质体和单微泡组细胞比较。 结果 1.Sono Vue微泡的一般形态显示良好。亲脂性荧光染料DiI成功对SonoVue微泡标记,标记浓度5μM时微泡荧光阳性率为(92.31±3.62)%。 2.流式细胞仪检测结果显示当DSPE-PEG-FITC(100μM)的浓度为20μL/mL时,微泡荧光阳性率达(94.7±6.4)%,为最佳浓度。生物素化微泡的亲和素靶向性实验显示洗涤后生物素化微泡保留在亲和素包被板上的数目明显多于未生物素化微泡。 3.旋转蒸发-超声波法成功制备荧光脂质体,平均粒径为272.6nm;并以戊二醛交联法成功耦联脂质体和微泡。 4.流式细胞仪检测结果显示每200μL的Sono Vue微泡混悬液内加入200μL脂质体,荧光阳性率达峰值(87.80±5.91)%。 5.多功能酶标仪检测结果显示每200μL的Sono Vue微泡混悬液内加入150μL的DSPE-PEG(2000)Amine,脂质体携带率达(83.41±2.21)%,提高DSPE-PEG(2000)Amine的量,并不能提高脂质体携带率。 6.超声造影模式下微泡的时间-强度变化显示,氨基化微泡与原始微泡声强下降速度之间的差异没有统计学意义(P＞0.05),但是脂质体的耦联使其声强下降速度增快,与原始微泡比较,两者之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。 7.与单脂质体和单微泡组细胞比较,MCF-7和SMMC-7721细胞与脂质体-微泡复合载体接触并经超声辐照后,细胞内荧光信号明显增多。 结论 商品化造影剂Sono Vue微泡可通过嵌入DSPE-PEG(2000)Amine分子实现氨基化,脂质体作为药物或基因的运输体,在脂质体膜成分中加入具有活性氨基的磷脂,可以戊二醛交联法实现氨基化微泡和脂质体的耦联。而且我们可通过改变修饰微泡及脂质体的活性基团,选择能获得更高的耦联效率及更简便的制备方法。 利用靶向微泡作为显影手段及靶向载体时,往往需要在构建微泡的过程中根据不同的疾病添加靶向分子及药物,如此就要制备多种微泡。本实验结果显示只需制备一种微泡,在微泡成品后添加不同的靶向分子及含不同药物、基因的脂质体,明显简化操作程序,更加灵活方便,具有较大实践意义。